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金黄色葡萄球菌检测细则
金黄色葡萄球菌是生活中最常见的病原菌之一，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。其对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。容易受该菌污染的食品主要为乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次是含有乳类的冷冻食品等，因此金黄色葡萄球菌的检验也被确定为食品致病性菌种检验中的重要项目。
按照现行的国标方法，金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量高的食品）及第三法MPN计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品）。
一、材料与设备：
1恒温培养箱: 36+1 °C。
2冰箱: 2~5 °C。
3恒温水浴箱:37+1C。
4天平:感量0.1g。
5均质器。
6振荡器。
7无菌吸管: 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.ImL刻度）或微量移液器及吸头。
8无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。
9无菌培养皿：直径90mm。
10注射器：0.5mL。
11pH计或pH比色管或精密pH试纸。
二、培养基和试剂
1、10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤
2、7.5%氯化钠肉汤
3、血琼脂平板
4、Baird - Parker琼脂平板
5、脑心浸出液(BHI) 肉汤
6、兔血浆
7、磷酸盐缓冲液
8、营养琼脂斜面。
9、革兰氏染色液。
10、无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121°C高压灭菌15 min。
11、1mol/L氢氧化钠(NaOH):称取40g氢氧化钠(NaOH )溶于1 000 mL蒸馏水中。121mol/L盐酸(HCL):37%浓盐酸90mL，加蒸馏水到1000mL。
三、操作步骤：第一法定性检验过程包括样品处理、样品增菌、平板分离划线、初步鉴定、确证鉴定五个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。第二法平板计数法包括样品稀释、样品接种涂布、典型菌和可疑菌计数、鉴定试验、结果计算五个步骤，整个流程全部完成至少需要4天时间。第三法MPN计数法包括样品稀释、样品增菌、平板分离划线、鉴定试验、查MPN表确认结果五个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。下面对金黄色葡萄球菌的检测流程进行简单介绍，对难点、注意事项进行梳理讲解。
1 第一法：金黄色葡萄球菌定性
1.1 样品处理
固态和半固态样品：称取25g样品盛至有225mL7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀。
液体样品：吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
1.2 样品增菌
将上述样品匀液置于36℃±1℃的恒温培养箱中培养18~24h。
图1 样品处理
1.3 平板分离划线
该步骤是整个金黄色葡萄球菌检测环节最重要的步骤之一，因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。平板划线选择三分法或四分法，分离效果好，更容易出现单菌落平板。
1.4 初步鉴定
分离的培养基选用Baird-Parker平板（BP）和血平板。金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。在血平板上，形成的菌落较大，呈圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。结合两种培养基特性即可确定可疑菌落。
图2 血平板（左）与BP平板（右）
1.5 确证鉴定
1.5.1 染色镜检
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞和荚膜，直径约为0.5~1μm。
图3 镜检
1.5.2 血浆凝固酶试验
挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个则全选)，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，在36°C±1°C条件下培养18~24h。
购买冻干兔血浆，按照说明加入0.5mL无菌生理盐水溶解，然后加入0.3mL BHI培养物，轻微摇晃至完全溶解或按照说明直接将0.8mL BHI培养物加入到冻干兔血浆中轻微摇晃至完全溶解（一般选用后者），置于恒温培养箱中，每半小时观察一次凝集情况，连续观察6h（根据经验，若强阳性，一般1~2h就可凝集，有的甚至长达3h才会凝集。需注意，切忌直接放6h才进行观察，因为凝固后会发生自溶现象，隔夜自溶是常见的判断。凝集的最好方法就是倒立观察结块，如倒立后内容物不下落，则效果较好。
图4 典型菌落、阴性及阳性对照凝集效果
1.5.3营养琼脂纯化
典型金黄色葡萄球菌在营养琼脂上一般呈黄色，较为容易判断，有些呈淡色、白色，但不常见。如果认为结果可疑，可挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18~48h，重复试验。
2 第二法：金葡平板计数法
2.1 样品稀释
固态和半固态样品：称取25g样品至盛有225mL稀释液中（可选用0.85%的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液）充分混匀，即为稀释度10-1溶液，之后进行梯度稀释。
液体样品：吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
2.2 样品接种涂布
选择性平板采用BP平板，该平板可提前一天配制——洁净台中放置过夜或置于25~50℃培养里干燥，直到平板表面的水珠消失备用。该步骤的目的是检查是否染菌，最重要的是挥发培养基内部水分，以利于涂布。每个梯度分别吸取1mL样品匀液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别接种于三块BP平板上，后用无菌涂布棒涂布整个平板。如涂布棒不是一次性的，可以提前灭菌备用，也可用酒精灯灼烧2min以上冷却备用。涂步时尽量涂干，注意不要触及平板边缘。涂布后将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36°C±1°C培养1h。等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±1℃培养24~48h（倒置培养的目的在于防止空气中菌的交叉污染，还可防止培养基水分挥发太快），观察结果。
2.3 典型菌和可疑菌计数
图5 不同稀释度条件下的菌落生长状态
从图5可以看出，10-1稀释度下菌落生长杂多，难以计数；最适计数范围为20~200CFU，故10-2稀释度满足计数要求，可疑菌总数在适宜计数范围内；而10-3稀释度下可疑菌落很少，舍去。从10-2梯度上可以看出，具有沉淀环的菌落很多，这就需要从这些菌种选择5个或以上可疑菌落进行血浆凝固酶试验，但是这5个菌落该如何选择才能使最终的结果最接近真实值是需要技巧的。
首先可以观察到，平板上的可疑菌落沉淀环有两种，一种是和菌落有点距离的沉淀环，记为可疑菌1，（可疑菌1经过后期确认试验可知此菌为干扰菌-表皮葡萄球菌），另一种是从菌落边缘直接延伸出来的沉淀环，记为可疑菌2。将所有可疑菌1与所有可疑菌2的菌落数出来，可判断出可疑菌落是两类不同的菌。根据两者菌落数的比例多少，决定挑选可疑菌落数的分配情况，比例大的多选，比例小的少选。
2.4 鉴定试验
平板法的鉴定试验过程及注意事项按第一法的“1.4”“1.5”进行。
2.5 结果计算
1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20~200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算；
2若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算；
3若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算；
4若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20~200CFU范围内，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算；
5若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20~200CFU之间，应按式(2)计算。
式(1)中，T为样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A为某一稀释度典型菌落的总数；B为某一稀释度鉴定为阳性的菌落数；C为某一稀释度用于鉴定试验的菌落数；d为稀释因子。
式(2)中，T为样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1为第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数；B1为第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数；C1为第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数；A2为第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数；B2为第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数；C2为第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数；1.1为计算系数；d为稀释因子(第一稀释度)。
3 第三法：金黄色葡萄球菌MPN计数
3.1 样品稀释
按照“2.1”进行。
3.2 样品增菌
根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1mL样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1mL，则用双料7.5%氯化钠肉汤)。每个稀释度接种3管，将上述接种物于36℃±1℃培养18~24h。用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环，移种于Baird-Parker平板，36℃±1℃下培养24~48h。
3.3 平板分离划线
用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环，移种于Baird-Parker平板，36℃±1℃下培养24~48h。
3.4 鉴定试验
MPN法的鉴定试验过程及注意事项按第一法的“1.4”“1.5”进行。
3.5 查MPN表确认结果
MPN结果按GB 4789.10-2016中附录C查询：
4 总结
以上便是金黄色葡萄球菌检样三种方法的简单操作过程。该菌检测过程的关键步骤是划线分离和可疑菌落的判定，其中不要放过任何一个可疑菌落；检测人员进行血浆凝固酶试验时，需要注意对时间和凝固现象的把控，有些细节的处理还需要大量经验的积累。
